на твердом агаре, что подтверждает их адаптацию к плазме растительной клетки. У Вольфа мицелий эндофитов обычно рос глубинно и только изредка возникал воздушный мицелий со спорангиями на поверхности питательной среды, что, но нашему убеждению, указывало на загрязнение чистых культур эндофитов, которые никогда не образуют воздушного мицелия. Примененный автором метод стерилизации корней был оригинален, но ненадежен. Для освобождения от поверхностных плесневых грибов автор помещал корни в питальный раствор Кнопа и после прорастания и удаления наружных грибов промывал корни спиртом. Процедура повторялась 3 раза, что не всегда избавляло препараты от загрязнения другими грибными культурами.
До сих пор выделение чистых культур эндофитов удавалось немногим исследователям, которые сами не могли установить основную причину успеха. Так, Р. Фрейслсбен (Freisleben, 1933, 1936) пытался выделить чистые культуры эндофитов из 42 растений, но ему удалось получить их только в одном случае из сильно микотрофного растения черники (Myrlillus). У этого эндофита не было спороносящих органов размножения, и он состоял из многоклеточного мицелия. При заражении эндофитом семян различных растений у них повышалась всхожесть, усиливались рост растений и развитие микоризы. Е. Поммеру (Pommer, 1959) удалось выделить многоклеточный эндофит из клубеньков ольхи (Alnus glutinosa) на обычной питательной среде, обогащенной соком из поверхностно стерильного клубенька этого растения после освобождения его от кожицы. До Поммера из клубеньков ольхи некоторые исследователи выделяли только актиномицеты, которые являются необязательными их компонентами. Автор подчеркнул медленный рост эндофитов и гранулированное строение их плазмы, а также образование везикул. При заражении стерильно выращенных проростков ольхи чистой культурой эндофитов на их корнях через 4-6 недель образовались клубеньки, тогда как у контрольных растений они не возникали. Это, по мнению автора, доказывало, что появление клубеньков у небобовых растений определяется грибами, а не актииомицетами. Однако Поммеру не удалось на основании своего метода выделить эндофиты из клубеньков других небобовых растений.
А. Келли (1952) считал, что в природе не существует специальных микотрофных грибов, а имеется только «микоризное состояние» любых почвенных грибов, обладающих способностью интенсивно внедряться в ткани растений. Этим недоказанным утверждением А. Келли оказал плохую услугу науке о симбиотрофном существовании растений, поскольку многие исследователи восприняли данное ошибочное положение как аксиому. Отрицание специфичности и особой ферментативной направленности у различных микроскопических грибов противоречит успехам, достигнутым технической микробиологией в синтезе определенных органических веществ или антибиотиков.
Некоторые ботаники считают возможным перерождение симбионтных грибов в паразитарных и наоборот. Однако это утверждение явно ошибочно, так как такое перерождение должно сопровождаться перестройкой их ферментативного аппарата в процессе выполнения противоположных по своему характеру действий. Также нельзя согласиться с указаниями Б. Моссе (Mosse, 1969, 1973), что симбионтными грибами являются фикомицетные эндогоновые грибы, разлагающие лесную подстилку. Если бы эти грибы действительно заразили растение, то они произвели бы в нем такую же разрушительную работу, как в подстилке. Б. Моссе в противоположность своим предшественникам Ш. Тернец (Ternetz, 1907) и М. Рейнер (Rayner, 1929) придерживалась теории заражения корней растений эндофитами в почве, так как, по ее представлениям, генеративные органы растений не содержат эндофитов, что было ошибочно подтверждено и Л. В. Крюгер (1969). Для заражения Б. Моссе предпочла использовать сапрофитный фикомицетный гриб из семейства Endogonaceae. Заражение стерильных семян различных растении спорокарпиями этого гриба приводило иногда к желаемым результатам, и в корнях опытных растений образовывалась, по ее мнению, «везикулярно–арбускулярная фикомицетная микориза». Б. Моссе (Mosse, 1969) усиливала заражаемость эндогоновыми грибами, включая ризосферную бактерию из рода Pseudomonas, после чего получила более убедительные доказательства значения поверхностного заражения стерильных семян для образования эндотрофной микоризы фикомицетного типа.
Ни Б. Моссе, ни ее последователи в нашей стране Л. В. Крюгер и И. Л. Селиванов (1976), включая в процесс заражения новый фактор — ризосферные бактерии, не определили отдельно степень участия данного фактора в образовании указанных микориз. Между тем это избавило бы исследователей от необходимости проводить кропотливую работу по разработке метода получения эндогоновых грибов из лесной подстилки, так как желаемая микориза образовалась бы при действии одной ризосферной бактерии, вместе с чем отпала бы необходимость считать ее фикомицетной.
Вряд ли теоретически можно допустить, что сапрофитные грибы, обладающие набором ферментов для разрушения мертвых растительных остатков лесной подстилки, способны осуществлять в корнях растений многочисленные синтетические процессы, поскольку такая универсальность несвойственна микроорганизмам.
Для окончания затянувшейся на несколько десятилетий дискуссии о природе и происхождении грибных симбионтов растений назрела необходимость в разработке метода выделения чистых культур эндофитов с целью установления их морфологии, физиологии, происхождения и сущности взаимосвязи с растениями. Неудачные опыты многих исследователей, предпринимавших попытки решить этот вопрос, заставили нас искать новые пути получения таких культур.
Метод выделения эндофитов. Наша работа по выделению чистых культур эндофитов из корней растений была начата с выяснения надежной стерилизации поверхности корней, не нарушающей жизнедеятельности находящихся внутри них живых организмов. Было установлено, что применение 2-3‑минутной обработки тонких корешков сулемой в концентрации 1 : 1000 и последующая отмывка сулемы спиртом и многократно стерильной водой обеспечивают стерильность поверхности корня и не нарушают жизнеспособности эндофитов. Это же достигается при короткой обработке 30%‑ной перекисью водорода.
Состав питательной среды. После долгих поисков мы остановились на следующей буферной питательной среде (г на 1 л воды): глюкоза — 8; К2НРО4 — 0,3; КН2Р04— 0,9; MgS04 — 0,2; K2SО4 — 0,1; FeS04 и MnS04 — следы, аспарагин — 0,01.
Нам удалось также установить основную особенность симбионтных грибов растений — их потребность в ростовых веществах в короткий период прорастания из растительной ткани в питательную среду и, как мы увидим дальше, в процессе прорастания из семени в корень, В обоих указанных случаях без наличия гормонального воздействия извне эти грибы не прорастают (Гельцер, 1973а, б). В редких случаях при сильной микотрофности растений и, очевидно, достаточной концентрации гормональных веществ в тканях их корней, а также при небольшом разведении питательной среды эндофиты прорастают без добавления ростовых веществ. Так были получены чистые культуры эндофитов из черники (Freisleben, 1936), корней зеленых орхидей (Wolff, 1926) и из ирисов в наших опытах.
В качестве ростовых веществ могут быть использованы спиртовые вытяжки из различных гименомицетов и фитобактериомицета, который изготовляется из актиномицета (Actinomyces lavendulae), ризосферных бактерий или наших препаратов, изготовленных из эндофитов и получивших авторские свидетельства: Симбионт I (Гельцер, 1973а) и Симбионтм2 (Гельцер, Игнатьев, 1982). Во всех случаях количество добавляемых в питательную среду ростовых веществ должно быть минимальным при экспериментально установленной концентрации препарата.
