class="p1">За исключением указанной особенности эндофитов, нами не выявлено каких–то их особых требований к составу питательных сред. В качестве энергетических веществ эндофиты хорошо усваивают глюкозу, сахарозу и крахмал, но неспособны использовать органические кислоты (кроме янтарной), целлюлозу и лигнин.
Заканчивается подготовка к выделению чистых культур эндофитов внесением в каждую колбочку гормональных веществ (по 2-3 капли препарата Симбионтм1 или других активных веществ). После прорастания мицелия эндофитов, которое происходит через 5-12 суток, для освобождения от корней мицелий пересевают в колбы с указанной питательной средой без добавления гормональных веществ, которые грибы синтезируют сами. Так как эндофиты обладают азотфиксацией, то применение минимальных доз азота сохраняется и для их дальнейших пересевов, чтобы при многолетнем культивировании этих грибов в лаборатории не нарушать их способности использовать атмосферный азот, о чем мы подробно расскажем в главе 3.
Чистые культуры эндофитов. Разработанная методика выделения эндофитов обеспечивает получение их чистых культур из любых растений, т, е. из сильно и слабо микотрофных, а также растений, считающихся не микотрофными из–за того, что визуально в их корнях под микроскопом эндофиты не были обнаружены.
Мы выделили чистые культуры эндофитов из корней следующих водных растений: рдестов (Potamogeton natans L.), тростника (Phragmites communis Trin.), белокрыльника (Calla palustris L.) и рогозы (Tipha latifolia L.). Замедленный рост и слабое наращивание мицелия заметно отличают чистые культуры водных от сильно микотрофных сухопутных растений, описание которых приводится ниже.
Мать–и–мачехa (Tussilago farfara L.). Эндофиты из корней этого растения ежегодно выделялись в нашей лаборатории па протяжении 9 лет и постоянно получались одинаковые результаты. Четко септированный многоклеточный мицелий, заполненный зернистой плазмой, никогда не спороносит. При старении в мицелии образуются круглые везикулярные вздутия (рис. 10), хорошо окрашиваемые анилин–бляу. Мицелий гриба в жидких средах растет погружённо, образуя студенистую массу вначале темно–зеленого цвета, а в дальнейшем — черного. Пигмент не переходит в раствор. Эндофиты, выделенные из молодых завязей этого растения, окрашены в золотисто–желтый цвет, как и его цветок.
Рис. 10. Везикулы о старом мицелии чистой культуры эндофитов из корней мать–и–мачехи
Вишня (Primus cerasus L.). Эндофит из корней вишни ежегодно выделялся в течение 8 лет. Сильно септированный мицелий с гранулированной плазмой золотистого цвета выделяет в раствор пигмент густо–вишневого цвета. Много шарообразных везикул, образующих цепочки. Спороносящие органы не обнаружены. При нагревании до 60° мицелий теряет жизнеспособность. В жидких средах растет погруженно.
Облепиха (Hippophae rharnnoides L.). Чистая культура эндофита 2 года выделялась из клубеньков и корней. Многоклеточный четко септированный мицелий. иногда с веретенообразными клетками, заполненными гранулированной плазмой. Мицелий преимущественно выделяет коричнево–бурый пигмент.
Клевер (Trifolium pratense L.). Отличительной особенностью эндофитов этого растения, ежегодно выделявшихся нами в течение 7 лет, является хрупкость молодого мицелия, который легко обламывается, при этом кусочки гиф накапливаются на дне колбы. Извлеченные стерильным капилляром, такие отрезки гиф в новой питательной среде образуют такой же мицелий с отпадающими отростками. Многоклеточный мицелий клевера синтезирует красный пигмент. Плодоносящие органы не наблюдались.
Пшеница (Triticum vulgare Vill.). Ежегодно выделялись в течение 5 лет эндофиты из корней разных пшениц. Сильно септированный мицелий образует рыхлую массу, обычно окрашенную в красный цвет. При старении на концах гиф образуются везикулярные вздутия. Рост гриба в жидкой среде погруженный. Плодоносящие органы не наблюдались.
Ирисы (Iris germanica L.). Эндофиты из корней растения ежегодно выделяли 8 -лет. Многоклеточный мицелий в начале роста с удлиненными, а в дальнейшем — с почти круглыми клетками, заполненными гранулированной плазмой, при старении образует темно–зеленую слизистую массу. Иногда мицелии был окрашен в розовый цвет, что, очевидно, зависит от сорта растения. Плодовые органы не наблюдались. При нагревании мицелия до 60° он терял свою жизнеспособность.
Любка (Platanthera bifolia Rchb.). Топкие, слабо септированные гифы при старении образуют четко септированный мицелий (рис. 11). Его отличительной особенностью является белый цвет. За 7 лет выделении эндофитов только один раз мицелий был окрашен в черный цвет. При погруженном росте плодоносящие органы не наблюдались.
Рис. 11. Мицелии чистой культуры эндофита из корней любки
Вереск (Calluna vulgaris Salisb.). Эндофит этого растения выделялся б лет. Четко септированный мицелий, заполненный гранулированной плазмой, растет погружен но. При старении гифы темнеют и приобретают, как и у всех сильно микотрофных растении, темно–зеленый или черный цвет. Эпдофит, выделенный из цветущей ветки этого растения, синтезировал фиолетовый пигмент. В остальном все так же, как у вышеописанных культур.
Можно было бы представить более 100 подобных описаний чистых культур эндофитов, в которых варьировала бы окраска пигментов и их способность переходить или не переходить в раствор. Эндофиты синтезируют пигменты всех цветов. Так, гриб, выделенный из герани, всегда окрашивался в желтый цвет, но однажды оказался фиолетовым. Выяснилось, что эта герань цвела фиолетовыми цветами.
Общими морфологическими показателями для всех выделенных чистых культур эндофитов были следующие: 1) отсутствие спороносящих органов размножения; 2) многоклеточный мицелий, принимающий по мере старения четко септированную форму с везикулярными расширениями; 3) гранулированная плазма, рассыпающаяся при разрыве оболочки клетки; 4) погруженный рост в жидкой среде при отсутствии поверхностного мицелия; 5) способность синтезировать пигменты разных цветов.
Отличие в развитии мицелия у водных растений заключалось в крайней медлительности их роста в первый год выделения в питательных средах. Только после многих пересевов на протяжении года в богатых углеводами средах они уже ничем не отличались от симбионтных грибов сухопутных растений. Создавалось впечатление, что в корнях водных
