растений эндофиты голодали и понадобился год частых пересевов в богатых углеводами питательных средах для того, чтобы придать им характерную форму, обычную для эндофитов сухопутных растений.
Разработанная методика получения чистых культур настоящих эндофитов открывает широкие возможности для развития науки о симбиотрофном существовании растительного мира. Ее применение способствует устранению многих спорных вопросов, обременяющих изучение грибного симбиоза растений.
Во введении к разделу об эндотрофной микоризе Дж. Харли (1963, с. 134) сообщает, что «наиболее ярким признаком, позволяющим разделить все типы эндотрофной микоризы на две большие группы является членистость (септированность) их гиф. Гифы могут быть септированными, как у аскомицетов, несовершенных грибов и базидиомицетов, или, наоборот, несептированными, например, у фикомицетов». Это утверждение как бы обобщает выводы различных авторов по данному вопросу, поскольку одни твердо убеждены, что эндофиты принадлежат к фикомицетам, а другие — к несовершенным грибам гифомицетам. Никто из авторов не установил, что определенным семействам растений соответствует один из двух указанных видов грибов. Напротив, дли семейства злаковых растении одни исследователи отмечали наличие септированного мицелия, а другие — несептированного. Очевидно, это расхождение определялось тем, что авторы выделяли из корней пшениц разные грибы. Мы всегда наблюдали в корнях всех растений у хорошо развитого мицелия только многоклеточное строение эндофитов, что подтвердилось при выделении их чистых культур.
При микроскопическом изучении выявление перегородок у мицелия эндофитов, растущих в тканях растений, представляет известные трудности даже после мацерации препаратов в щелочи. В молодых гифах перегородки плохо просматриваются в препаратах. В старых гифах, образующих клубки и петли, они видны отчетливо. Дж. Харли (1963) считал, что микориза у злаковых и бобовых растений относится к фикомицетному типу. Выделенные нами дополнительно для проверки его утверждения чистые культуры эндофитов из люцерны, гороха, вики, акации и бобов всегда имели многоклеточный мицелий, как и эндофиты из ржи, овса, тимофеевки, ежи, пырея и кукурузы. Многие исследователи, применив электронный микроскоп, подтвердили многоклеточную природу эндофитов.
Из всего изложенного следует, что обычно принятое и уже ставшее трафаретным положение о наличии у растений «везикулярно–арбускулярной фикомицетной микоризы» не соответствует действительности и не может быть признано научно доказанным.
Многоклеточное строение гиф эндофитов не дает основания причислить их к роду Rhizoctonia, от которых они отличаются как по морфологическим, так и по физиологическим свойствам. Сравнивая мицелий эндофитов с Rhizoctonia solani u R. ailcrholdii, выращенных в одинаковых по составу питательных средах, можно установить, что последние не образуют везикулярных вздутий, не имеют гранулированной плазмы, как эндофиты, и не синтезируют пигменты. Кроме того, обе культуры Rhizoctonia не обладают азотфиксирующей способностью и не синтезируют гормональных веществ. Все указанные различия заставляют отказаться от причисления эндофитов к указанному роду.
Многовековая адаптация эндофитов к растительной клетке, постоянство морфологических признаков при выполнении ими определенных функций, в том числе и защитного характера (см. главу 5), исключают участие в этом сложном взаимодействии случайного сообщника при заражении корней в почве естественным путем или исследователем в эксперименте. Отсутствие спороносящих органов заставляет отнести эндофиты к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecli), где они могут быть выделены в особый порядок симбиофитов — Symbiophytum, отличительной особенностью которых могут являться их морфология и физиологическая способность к синтезу определенных соединений.
Метод получения чистых культур эндофитов из корней растений дал возможность не только составить правильное представление об их морфологии, по и обнаружить наличие эндофитов в корнях тех немногих растений, у которых из–за слабого развития симбионта он не мог быть визуально обнаружен под микроскопом.
Нам предстояло использовать этот метод для решения еще одного вопроса — вопроса о наличии эндофитов в надземных частях растений, что необходимо для доказательства наследственной передачи симбионтных грибов от семени к семени.
В руководимой нами лаборатории О. И. Громыко установила, что чистые культуры эндофитов хорошо выдерживают лиофильное высушивание и длительно сохраняют свою жизнеспособность в сухом состоянии. При прорастании в питательных средах с ростовым веществом они синтезируют пигменты тех же цветов, которые были им свойственны до сушки. Как известно, мицелий плесневых грибов не выдерживает лиофилизации.
Наличие у эндофитов в корнях растений гиф с такими характерными образованиями, как везикулы, арбускулы и спорангиолы, в которых накапливаются белковые продукты их синтеза, хорошо окрашиваемые аиалин–бляу в фиолетовый цвет, а также расположение гиф вдоль коровой паренхимы не оставляют сомнений и их принадлежности к симбионтным грибам.
В мацерированных щелочью листьях и хвое различных растений обнаруживаются слаборазвитые гифы грибов, но их признаки еще не определяют принадлежности к эндофитам.
В книге, посвященной биологии микориз, Дж. Харли (1963), приводя мнение многих авторов о наличии эндофитов в надземных частях растений, подчеркивал его недостоверность, так как все авторы отмечают «ослабленное» состояние гиф в листьях. Только применяя метод выделения чистых культур эндофитов, можно решить вопрос о присутствии симбионтных грибов в надземных частях растений.
Листья и хвоя растений стерилизовались сулемой, спиртом и промывались стерильной водой, после чего их помещали в стерильные чашки Петри с небольшим количеством питательного раствора и 1-2 каплями ростового препарата Симбионт I. Одновременно стерильность листьев проверяли на твердых питательных средах. Спустя 10-15 дней эндофиты из листьев прорастали, что отчетливо просматривалось в микроскопических препаратах, а еще через несколько дней стало возможным выделение их чистых культур. Последние были получены из листьев таких сильно микотрофных растений, как вереск, мать–и–мачеха, брусника, черника, дуб, ольха, липа и др., а также из слабо микотрофных растений картофеля и пшеницы.
В первый период роста мицелий из листьев заметно отличался от мицелия из корней простотой своего строения, малой разветвленностью гиф и слабо очерченными перегородками. Только при длительном культивировании в лабораторных питательных средах с пересевами через каждые 2-3 месяца гифы становятся более разветвленными и широкими, с четко очерченными перегородками и гранулированной плазмой, с везикулярными вздутиями, характерными для эндофитов из корней. Скорость изменения строения гифов определяется степенью микотрофности растений. Для выделения эндофитов из листьев дуба, липы, ольхи, вереска, мать–и–мачехи и других сильно микотрофных растений достаточно было несколько месяцев, тогда как эндофиты из листьев слабо микотрофных растений нуждались в культивировании в течение 1-2 лет (рис. 12). Становится очевидным, что «ослабленное» состояние и «упрощенное» строение эндофитов определяются их неспособностью использовать для питания продукты фотосинтеза листа или отсутствием последних в листе. Возможно, упрощенность функций эндофитов в надземных частях растений связана с отсутствием у них везикул, арбускул и гранулированной плазмы, а основное их назначение сводится к наследственной передаче симбионтных грибов в пыльцу и семена.
