phiC31 необходимо было охарактеризовать его физически. Это было сделано Ириной Алексеевной Сладковой, нашей многолетней коллегой, физиком по образованию. В статье, опубликованной в журнале Генетика, т. 13, стр. 342–344, 1977 г. в соавторстве И. А. Сладковой, Н. Д. Ломовской и Т. А. Чиненовой, было показано, что геном актинофага phiC31, также как и геномы большого числа бактериофагов, представляет собой линейную молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая была детально охарактеризована и в двух последующих статьях И. А. Сладковой, опубликованных в журн. Молекулярная Биология, 1980, т. 14, стр. 1131–1136 и 1137–1141.
В конце 1970-х годов мы попытались изолировать дополнительно фаги, действующие на штаммы S.coelicolor А(3)2 и S.lividans 66, из имеющейся у нас большой коллекции родственных штаммов актиномицетов, т. к. после обнаружения фага phiC31 мы не предпринимали таких попыток. Два лизогенных штамма были обнаружены Таней Чиненовой. Анализ строения ДНК фагов, образуемых этими лизогенными штаммами, проводился И. А. Сладковой, а их фенотипические и генетические признаки вместе с Таней изучали Лиля Васильченко, Нора Мкртумян, а впоследствии и Ольга Клочкова. Оба обнаруженные фага phiC62 и phiC43 по данным гетеро-дуплексного анализа оказались практически гомологичными фагу phiC31. Фаг phiC31 отличался от фага phiC62 только наличием небольшой делеции. Фаг phiC62 был идентичен фагу phiC31 и по всем проверенным фенотипическим признакам. А вот изучение фага phiC43 принесло нам много интересных фактов. Этот фаг тоже был практически гомологичен фагу phiC31, но имел в отличие от него чужеродную вставку в несущественной для литического развития фага области генома, которая была обнаружена с помощью гетеродуплексного анализа.
Образованные в результате спонтанной индукции лизогенного штамма мутные негативные колонии phiC43 имели разную морфологию. Этот признак, как оказалось, отражал наличие у этих вариантов фага различий в структуре их ДНК. Кроме того, практически все они обладали важным фенотипическим признаком — отсутствием способности к лизогенизации чувствительных штаммов. Так мы впервые столкнулись с появлением актинофаговых мутантов, не способных к интеграции в хромосому актиномицета.
Оказалось, что чужеродная вставка включалась в фаговый ген, контролирующий синтез фермента интегразы. (ж. Генетика, 1979, стр. 1953-62. Соавторы статьи И. А. Сладкова, Т. А. Чиненова, Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян). Конечно, мы сразу стали изучать возможность появления делеционных мутантов, образующихся в результате утраты фрагментов фагового генома среди вариантов фага phiC31, изолированных после обработки фага хелатирующими агентами, в том числе, и не способных к поддержанию и к установлению лизогенного состояния. Получение и характеристика большого набора делеционных мутантов фага phiC31, в том числе не способных к поддержанию лизогенного состояния с-мутантов и к установлению лизогенного состояния lyg-мутантов, стало настоящим подарком наших генетиков И. А. Сладковой, блестящему специалисту в области гетеродуплексного анализа ДНК. Первые полученные результаты по локализации делеционных мутантов на физической карте ДНК актинофага phiC31 были опубликованы в журн. Молекулярная Биология, 1980, том 14 стр. 918–915 и 916–921. Соавторами первой статьи были И. А. Сладкова, Л. Г. Васильченко, Н. Д. Ломовская и Н. М. Мкртумян, а второй — И. А. Сладкова, Т. А. Чиненова. Л. Г. Васильченко, Л. Б. Пельтс и Н. Д. Ломовская. Каким же урожайным на публикации статей по физическому и генетическому изучению фага phiC31 оказался 1980 год! Нашими генетиками в дальнейшем было получено и изучено генетически большое число делеционных мутантов актинофага phiC31, различающихся по фенотипам. Представители делеционных мутантов различного фенотипа были локализованы на генетической карте актинофага phiC31 (журн. Генетика, 1981, том 17, стр. 1967–1974, статья в соавторстве Л. Г. Васильченко, Н. М. Мкртумян и Н. Д. Ломовской). Это позволило установить соответствие генетических и физических карт этого актинофага и расположить на физической карте не только делеционные мутанты, но и температурочувствительные и другие мутанты этого фага.
Гетеродуплексный анализ ряда делеционных мутантов фага позволил идентифицировать в геноме фага непрерывную, значительную по длине область фагового генома, не существенную для его литического развития. В этой области среди делеций были локализованы на молекуле ДНК и мутанты в гене, контролирующем синтез фермента интегразы. Идентификация такой несущественной для литического развития фага области его генома открывала большие возможности для конструирования на его основе фаговых векторов, в которых эта область могла быть замещена актиномицетными или другими генами. Неоспоримым преимуществом таких фаговых векторов перед векторами, полученными, например, на основе плазмидных геномов, являлось то, что гибридный фаг, полученный в модельной системе в результате трансфекции гибридной фаговой ДНК штамма S.lividans 66, мог с помощью простой инфекции доставлять чужеродные гены в другие штаммы актиномицетов для осуществления разнообразных задач, таких, например, как идентификация генов антибиотикообразования в штаммах-продуцентах, получения мутаций в этих генах, замены одних генов на другие в геноме актиномицетов и т. д.
Итак, представляется, что в Москве были заложены фундаментальные основы для использования актинофага phiC31 в качестве объекта генной инженерии и конструирования на его основе фаговых векторов. Повторюсь, что начиная с 1977 года была выпущена серия работ по подробной характеристике молекулы ДНК фага phiC31, составляющей его геном. Кроме того, впервые для получения делеционных мутантов была использована обработка фага phi31 хелатирующими агентами. Полученные делеционные мутанты были подробно охарактеризованы и локализованы на физической и генетической картах актинофага phiC31, что позволило установить соответствие физической и генетической карт актинофага phiC31. Изучение фага phiC43, гомологичного фагу phiC31, несущего в составе своего генома чужеродную вставку, позволило сделать выводы о максимальной длине молекулы ДНК, которая может быть упакована в фаговую оболочку. Кроме того, в геноме актинофага phiC31 была идентифицирована значительная по длине непрерывная область, не существенная для литического развития актинофага, которую можно было замещать клонированными генами.
В конце 70-х годов актиномицеты прочно завоёвывают свои позиции в качестве объектов генной инженерии в отделе Д. Хопвуда. Первой ласточкой оказалась работа по успешной трансформации плазмидной ДНК штамма S.lividans 66. Этот штамм был послан нами Д. А. Хопвуду в далеком 1970 году вместе с фагом phCi31 в качестве уникального чувствительного к этому фагу индикаторного штамма. В результате этот штамм оказался самым удобным реципиентным штаммом для введения в него изолированной плазмидной ДНК.
Прошло ровно десять лет с тех пор, как актинофаг phiC31 был послан нами в отдел Д. Хопвуда. Имея в своем распоряжении наш богатый багаж генетического и физического изучения генома актинофага phiC31, Кит Четер, наконец, выбрал в качестве основы для конструирования фаговых векторных молекул актинофаг phiC31.
Настоящим прорывом в решении задачи конструирования и использования фаговых векторов на основе фага phiC31 стала демонстрация трансфекции протопластов штамма S.lividans 66 с помощью изолированной ДНК этого актинофага. Это позволяло манипулировать с молекулой фаговой ДНК, а после трансфекции отбирать нужные жизнеспособные фаги,
