питательной смесью Гельригеля три различном содержании азота показал, что лучше всего это сильно микотрофное растение растет уже при 0,1% азота в смеси, обеспечивая себя атмосферным азотом, тогда как увеличение дозы азота до нормальной для таких растений, как пшеница или рожь, является гибельным для мать–и–мачехи.
Обстоятельный вегетационный опыт, поставленный в нашей лаборатории в полулитровых сосудах с силикагелем, с несомненностью подтвердил способность к азотфиксации сильно микотрофного растения мать–и–мачехи. Опыт проведен в двукратной повторности по следующей схеме: 1 — контроль — питательная среда без азота; 2 — питательная среда + 1,4 мг азота. В каждый сосуд высаживали по 4 проростка с зачатками листьев, которые в общей сложности содержали 11,0 мг азота. Через 2 мес. в надземной части и корнях растений, освобожденных от силикагеля, было определено содержание азота (табл. 4).
Таблица 4 Азотофиксация мать–и–мачехи за 2 мес. выращивания
Примечание. В посадочном материале содержался азот в среднем на сосуд 11,0 мг.
Наибольшая азотфиксации (29,2 мг на сосуд) наблюдалась при добавлении в «питательную среду всего 1,4 мг азота. Высокая микотрофность корней у мать–и–мачехи была установлена и в варианте без азота.
Как будет показано ниже, способность мать–и–мачехи к азотфиксации подтвердилась также в длительных опытах в лизиметрах. Именно благодаря данной способности это растение поселяется первым как на бедных аллювиальных песках, так и на глинистых материнских породах.
Чтобы доказать азотфиксирующую способность сильно микотрофных растений, следовало установить ее наличие у чистых культур эндофитов. Изучению азотфиксирующей способности выделенных чистых культур эндофитов предшествовал длительный подбор питательных сред и условий их культивирования, необходимых для выявления продуктивности этого процесса. Обильный рост мицелия эндофитов в питательных средах можно получить при добавлении к синтетической среде с сахаром вытяжек из растений, пивного сусла или кукурузного экстракта, но в этих случаях, т. е. при хорошем азотном питании, эндофиты не фиксируют азота, что характерно для всех азотфиксирующих микроорганизмов. Способность эндофитов фиксировать азот проявляется при минимальном количестве минерального азота или азота аминокислот в среде (0,1 мг/л), что определяет длительный период роста грибов (20-30 дней) для наращивания большой массы мицелия. Еще медленнее растут эндофиты в питательной среде, без азота. Понадобилось 2-3 мес. для получения хорошо развитого мицелия у мать–и–мачехи, который фиксировал за 72 дня 0,6 мг азота, а за 118 и 127 дней — 3,2 и 4,7 мг. Эндофит из ирисов за 118 и 123 дня в среде без азота фиксировал 2,5 и 3,0 мг азота.
Установив, что эндофиты используют для азотфиксации больше сахара, чем свободно живущие бактерии, мы уменьшили аэрацию путем их культивирования в широких пробирках при слое жидкости 10 см и замены минерального азота аспарагином или нуклеинатом натрия из расчета 5 мг на литр питательной среды № 22 с рН 5,8-6,6. В широкой пробирке 50 мл питательной среды заражали небольшим количеством мицелия эндофита. В начале опыта ежедневно взбалтывали пробирки для получения большого количества отрезков гиф. Затем их помещали на 30 дней в термостат при температуре 24-28° и доступе воздуха. После этого срока 5 мл среды брали для определения сахара по Бертрану, а 45 мл — для определения азота мицелии по Кьельдалю с применением перекиси водорода. Титрование проводилось с 0,01 н. растворами серной кислоты и щелочи. Было осуществлено около 500 определений содержания азота. Отмечено, что чистые культуры эндофитов зимой фиксируют немного меньше азота, чем весной и летом.
Чтобы избежать изменения культуры эндофитов при длительной их адаптации к лабораторным питательным средам, мы выделяли новые чистые культуры для определения их способности к азотфиксации. Особое внимание обращалось на отсутствие загрязнения лабораторного воздуха аммиаком. При протягивании воздуха через титрованную кислоту в течение нескольких дней не было обнаружено его наличия.
Полученные данные по азотфиксации чистых культур эндофитов приведены в табл.5.
Таблица 5 Азотфиксация чистых культур эндофитов
Многие авторы отмечают, что развитие эндофитов в корнях растений не зависит от степени кислотности почвы, но это еще не доказывает, что условия среды не влияют на активность их жизнедеятельности. При специальном изучении влияния кислотности питательной среды на азотфиксацию эндофитов мы получили интересные результаты (табл. 6).
Таблица 6 Азотфиксация чистых культур эндофитов (мг на 1 г сахара) при разных значениях рН среды
Наиболее значительно снизилась азотфиксация при увеличении кислотности среды с рН 6,4 до рН 5,5 у эндофитов» выделенных из пшеницы, кукурузы, ирисов, ольхи, в то же время эндофит из вереска не реагировал на повышение кислотности. При подкислении до pH 4,5 у всех эндофитов значительно снизилась способность к азотфиксации, что может служить объяснением более низкого содержания азота в зоне кислых подзолистых почв, чем в карбонатных черноземах.
Как видно из табл.6, абсолютная азотфиксация эндофитов, так же как и относительная (на 1 г использованного сахара), довольно значительна. Чистые культуры эндофитов, выделенные из клубеньков бобовых растении, не обладали повышенной способностью к азотфиксации по сравнению с эндофитами из корней этих растений. Поскольку в клубеньках бобовых растений имеется два микроорганизма, обладающих способностью к азотфиксации — клубеньковая бактерия и эндофит, мы сделали попытку выращивать их в лабораторных питательных средах совместно, что нам не удалось. Быстрое подкисление питательной среды было неблагоприятно как для эндофита, так и для бактерий. Очевидно, их совместное существование в клубеньке обеспечено нейтрализацией избыточной кислотности.
Установление азотфиксирующей способности эндофитов в питательных средах при минимальной дозе азота еще не дает права с уверенностью утверждать, что они могут осуществлять этот процесс в природных условиях, хотя эндофиты как симбиотрофные организмы более надежно обеспечены энергетическим материалом в природных условиях, чем свободноживущие азотфиксирующие бактерии. Все же для доказательства их участия в обогащении растений и почвы азотом нужно было установить, что сильно микотрофные растения фиксируют больше азота, чем слабо микотрофные.
Для изучения этого вопроса были созданы на территории ВИУАА бетонные лизиметры без дна размером 0,5 м2, которые были заполнены на глубину 80 см слабосортированной глиной, взятой с глубины 3 м, ниже которой находилась местная глинистая материнская порода. Материалы подробного химического и микробиологического исследования состава глины после 3 и 7 лет проведения этого
