в дальнейшем ограничивались промывкой их спиртом и стерильной водой.
В качестве гормональных препаратов были взяты спиртовые вытяжки из различных гименомицетов, таких, как белые грибы (Boletus edulis), мухоморы (В. scaber), скрипица (Lactarius vellereus), различные сыроежки (Russula), фитобактериомицин (ФБМ), изготовляемый из актиномицета (Actinomyces lavendulae), гиббереллин, а впоследствии и наш препарат Симбионт 1, продуцентом которого был эндофит, выделенный из корней женьшеня. Семена контрольных растений замачивались в стерильной воде, а опытных — с добавлением в нее 2-3 капель указанных выше ростовых веществ. После 2-4 недель роста растений в стаканах при хорошей освещенности, их корни отмывались от среды, мацерировались в щелочи и продольные препараты изучались под микроскопом при окраске анилин–бляу.
В отличие от поперечных срезов корней, обычно применяемых при изучении микотрофностн, продольные препараты дают возможность просмотреть содержание эндофитов в больших отрезках корня. В зависимости от количества полей зрения, в которых наблюдаются гифы эндофитов, арбускулы, спорангиолы и везикулы, а главное по форме и размерам последних дается оценка микотрофности растений по 5-балльной системе.
Хорошим объектом для изучения влияния ростовых веществ на однолетних растениях были сильно микотрофные просо сорта Саратовское 853 и пшеница сорта Сарубра. После намачивания контрольных семян 30 мин в воде, а опытных — с добавлением 2 капель спиртовых вытяжек из указанных гименомицетов и препаратов ФБМ, гиббереллина, их высушивали и высеивали. Через месяц роста растений на стерильных агаризованных почвенных вытяжках корни в опытных вариантах, кроме варианта с гиббереллином, значительно превосходили по размерам контрольные. Если это основное и самое характерное действие ростовых веществ не проявляется при хороших условиях роста растений, даже если отмечено небольшое улучшение развития эндофитов в корнях, то у изучаемого препарата явно отсутствует способность к гормональному воздействию. В контроле эндофиты не были визуально обнаружены под микроскопом, а в опытных вариантах у проса имелись характерные для него клубки септированных гиф и крупные круглые везикулы с оценкой в 3-4 балла. Подобные результаты получены и при изучении корней менее микотрофной культуры пшеницы.
Вторая серия опытов, проведенная с пшеницей сорта Сарубра, отличалась тем, что в них семена не обрабатывали вытяжками гименомицетов и препаратов, а последние вносили в стерильную среду. Результаты предыдущих опытов повторились, и микотрофность корней была установлена во всех опытных вариантах, но целесообразность использования такого приема для нестерильных почв должна быть проверена, так как в связи с их возможной минерализацией активность препаратов может снижаться.
Наши опыты с применением указанных гормональных воздействий для развития эндофитов в корнях в тех случаях, когда единственным источником их образования были поверхностно стерильные семена, подтвердили мнение исследователей о наследственной передаче грибного симбиоза в растениях. Окончательное признание «циклической наследственности» было связано с доказательством наличия эндофитов в надземных частях растений. Применение методов выделения чистых культур симбионтных грибов из листьев, хвои, завязей, пыльцы, семян и тканевых культур, выращенных из одной клетки в стерильных условиях вне организма, позволило установить присутствие эндофитов в надземных частях растений, чего нельзя было убедительно доказать с помощью визуального их изучения под микроскопом.
Рассмотрение вопроса о наследственной передаче грибного симбионта растений мы хотим закончить результатами изучения эндофитов у вегетативно размножаемых культур (черенками, усами) и у живородящих растений. Что касается картофеля, размножаемого в основном клубнями, то о нем подробнее будет сказано в других главах, так как наиболее важные выводы о значении микотрофизма были получены при изучении именно этой культуры.
Образующиеся миниатюрные зародыши на концах листьев живородящих растений Bryophyllum degramonlianum представляют собой интересный объект для изучения миграции симбионтных грибов в надземной части растений. Снятые с листьев материнского растения ростки имели 3-5 листочков и несколько тонких корешков. После промывания стерильной водой их помещали в закрытые ватными пробками стерильные, склянки с песком, смоченным питательным раствором с уменьшенным содержанием азота. Опыт включал контроль и 2 опытных варианта: с добавлением в среду 0,5 мл гиббереллина и с прибавкой 0,5 мл спиртовой вытяжки из гриба скрипицы. При обработке гиббереллином бриофиллум сильно, вытянулся, что характерно для действия этого препарата. Вытяжка из скрипицы способствовала лучшему развитию корней и листьев, чем в контроле. Через 40 дней при тщательном изучении корней у контрольных растений гифы грибов не были визуально обнаружены. В варианте с гиббереллином наблюдались большое количество типичных везикул и гифы эндофитов с оценкой в 2 балла. Наиболее сильная микотрофность корней была установлена у растений, обработанных метаболитами гименомицета. Здесь в большом количестве встречались многоклеточные гифы и скопления круглых везикул, ярко окрашенных анилин–бляу в фиолетовый цвет, с оценкой в 5 баллов. В данном опыте мы установили (передачу симбионтного гриба через стебель и листья материнского растения своему вегетативному потомству.
При образовании корней у веток ивы и тополя, помещенных в воду, в которую добавлялись питательные соли, визуально наблюдаемые эндофиты появились в короткий срок только в тех вариантах, где в среду вносили несколько капель метаболитов из гриба мухомора или подберезовика.
Такие же опыты были поставлены с семенами лука, укропа и клевера. Во всех случаях ростовые вещества из гименомицетов обеспечивали развитие эндофитов из семян растений, выращиваемых в стерильной среде, тогда как в контрольных вариантах эндофиты в корнях не развивались.
Приведенные результаты опытов, количество которых можно было бы значительно увеличить, не позволяют сомневаться в наследственной передаче эндофитов через прорастающее семя или вегетативные органы растений при непременном наличии в среде гормональных веществ растительного или микробного происхождения. Неясным, однако, оставался вопрос о сущности действия ростовых веществ: оказывают ли они влияние непосредственно на грибной симбионт или, создавая тонкую корневую систему растения, способствуют тем самым развитию в ней симбионта? Для ответа на него нужно было установить влияние гормональных препаратов на развитие растений в различных стерильных средах.
Обычно исследователей не удовлетворяют среды, в которых приходится ставить стерильные опыты. Дело в том, что для этой цели нельзя использовать почву, в которой в процессе стерилизации накапливаются токсические для роста растений вещества. Замена почвы водой с добавлением нужных питательных солей приводит к значительному изменению всего облика корневой системы, которая в водной культуре состоит из толстых слаборазветвленных стержневых корней при полном отсутствии корешков третьего порядка, т. е. тех, где хорошо себя чувствуют эндофиты (рис. 18). Несколько лучше развиваются корневые системы в песчаных средах, но и в них растения (потребляют питательные вещества из водного раствора, что не способствует образованию мельчайшей корневой системы, которая развивается в том случае, когда элементы питания находятся в поглощенном состоянии. Микробиологи часто применяют в качестве стерильной среды жидкое стекло или агаровые среды, которые представляют собой плохо аэрируемую плотную коллоидную массу, куда корни
