class="empty-line"/>
Участие симбионтных грибов в процессе оплодотворения растений может быть изучено под микроскопом. Нанесению пыльцы на рыльце и окраске их анилин–бляу должна предшествовать предварительная мацерация препарата в щелочи, что дает возможность отчетливо различать белок грибного происхождения по фиолетовой окраске и белок растительных клеток, окрашенных в голубой цвет.
Какие наблюдения цитологов подтверждают установленный нами факт наличия эндофитов в пыльцевой клетке?
При установлении двойного процесса оплодотворения яйца и вторичных клеток С. Г. Навашин (1951) отмечал проникновение спермия не только в зародышевый мешок, но и в окружающие его клетки нуцеллюса. Это явление было изучено и подтверждено Я. Е. Элленгорном и В. В. Светозаровой (1950), которые обнаружили, что полиспермия сопровождается подкисленном среды. Развитие легко распадающегося грибного мицелия при прорастании пыльны может объяснить явление полиспермии и также вызванное ростом гриба подкисление среды. В. Е. Козлов (1951), описывая цитологический процесс полиспермии у гороха, сообщает, что спермин при соприкосновении с яйцеклеткой разрыхляется и превращается в скопление множества гранул, в конце концов принимая вид длинных неправильных бусовидных нитей. В статье «Новый пример халацогамии» С. Г. Навашин (1951, С, 174) пишет: «Пыльцевые трубки грецкого ореха обладают способностью посылать боковые выросты, появляющиеся почти в любой точке пути пыльцевой трубки», В его груде представлены рисунки сильноветвящихся пыльцевых трубок в халаце. Сейчас, когда установлена способность пыльцевой клетки прорастать мицелием эндофитов, высказывание С. Г. Навашина служит подтверждением указанного процесса.
Как обычно, при изучении природных явлений новые наблюдения порождают новые исследования. Вот и в данном случае предстоит изучить, в чем заключается участие эндофитов в процессе оплодотворения? Служат ли их гифы транспортирующим средством для передвижения спермия в зародышевый мешок или они обеспечивают условия, благопрнятные для слияния двух разнополых клеток, а возможно, они гарантируют наследственную передачу грибных симбионтов растений однородного происхождения? Настоящий опыт показывает, как может гриб попасть в семена.
Нельзя не вспомнить раннюю работу Дж. Пекло (Peklo, 1913), который приложил много усилий, чтобы доказать наличие в семенах гиф грибов. Ему удалось слетать несколько снимков гиф в недозрелом зерне пшеницы. Он считал, что его богатый азотом алейроновый слой состоит из мицелия эндофитов, находящихся в состоянии анабиоза.
Мы разработали следующие приемы для получения чистых культур эндофитов из семян растений. После стерилизации поверхности семян их обрабатывали гормональным препаратом и помещали в стерильные чашки Петри для проращивания до образования первых корешков, после чего семена слегка растирали в стерильной агатовой ступке и переносили в питательную среду. Через несколько дней эндофиты начинают прорастать и скорость этого процесса зависит от степени микотрофности изучаемого семени.
В природных условиях гормональное воздействие на прорастающее семя оказывают эпифитные н ризосферные бактерии, которые обильно развиваются на прорастающем семени. Наиболее подробно эти бактерии были изучены Ю. М. Возняковской (1964), которая установила их способность синтезировать стимулирующие вещества, проникающие в ткани растении. Латвийский микробиолог Л. Л. Клинцаре (1970) создал из эпифитных бактерий препарат, стимулирующий рост растений, и получил на него в 1970 г. авторское свидетельство. При постановке стерильных опытов стерилизация семян лишает их гормонального воздействия указанных бактерий, в результате чего эндофиты из семян не переходят в корень.
Таким образом, метод выделения чистых культур симбионтных грибов способствовал выяснению сложного вопроса о распространенности эндофитов в надземной части растений. Его использование позволило установить наличие таких грибов во всех органах, включая пыльцу и семена. По вызывает сомнений, что синтетическая деятельность эндофитов сосредоточена в корнях, даже в тех случаях, когда нельзя визуально установить их наличие.
Наши четырехлетние исследования по выделению эндофитов из листьев, хвои, завязей, пыльцы и семян растений дают возможность установить, что источником грибной инфекции для корней и надземных органов растений служит прорастающее семя. Такая передача от семени к семени обеспечивает наследственную природу грибного симбиоза, а в ослабленном виде — и при вегетативном размножении от клубня к клубню, от луковицы к луковице и от черенка к саженцу. Для получения микотрофного растения в стерильных условиях нужно обработать семена гормональным препаратом растительного или микробного происхождения.
В природных условиях процесс образования эндотрофной микоризы происходит при активном участии симбионтных бактерий, когда в процессе прорастания семени значительно увеличивается количество эпифитных бактерий и их переход на поверхность молодых корней, где эти микроорганизмы рассматривают в качестве ризосферных бактерий. Продуцируемые ими биологически активные вещества активизируют выход симбионтных грибов, находящихся в алейроновом слое семени, и активное их прорастание в корни. При изучении нами первых корешков длиной 0,5 см в прорастающем семени можно было установить, что их поверхность покрыта слоем ризосферных бактерий. Стерилизация семян исключает возможность развития на них бактерий и тем самым продуцирование гормональных веществ, необходимых для прорастания эндофитов. Нанесение на стерильное семя гормональных препаратов обеспечивает развитие в корнях везикулярно–арбускулярной микоризы. Присвоение последней названия «фикомицетной» нужно еще суметь доказать тем исследователям, которые не хотят признать многоклеточную природу мицелия эндофитов (Гельцер, Кузнецова, 1977).
Вряд ли нужно увеличивать количество литературных примеров, чтобы прийти к выводу, что все значение производимых многочисленными авторами «заражений» стерильных семян различными грибами определятся добавлением некоторого количества гормональных веществ микробного происхождения, необходимых для активизации прорастания свойственных данному растению эндофитов из семян, клубней и луковиц, Вспомним, что выделение чистых культур эндофитов из любых частей растений стало возможным только после того, как была доказана необходимость наличия в питательных средах гормональных веществ. Как мы увидим дальше, эту зависимость симбионтных грибов от гормональных воздействий можно использовать для повышения их активности в корнях сельскохозяйственных культур.
Занимаясь изучением проблем происхождения эндофитов, мы не применяли «заражений» различными грибами, так как всегда считали эндофиты облигатными симбионтами, имеющими большое генетическое значение в сохранении вида растений. Нас интересовал вопрос о специфичности действия различных ростовых веществ на пробуждение эндофитов при прорастании семени, а также характер их действия: стимулируют ли они активность гриба или изменяют растение, создавая более благоприятные условия для развития грибов в корнях. Хотя наши опыты не сопровождались химическим изучением состава примененных ростовых веществ, они в качестве первой разведки могут представлять интерес, в особенности для решения второго вопроса.
В стерильных краткосрочных опытах по выяснению влияния различных стимулирующих веществ на развитие эндофитов из семени использовались следующие питательные среды: песок, почвенно–песчаная смесь, почвенные вытяжки с агаром при добавлении питательной среды Гельригеля. Этими средами заполнялись стаканы емкостью 200 мл, которые стерилизовались в автоклаве в зависимости от состава среды от 0,5 до 1 часа при 1 ат (0,1 МПа). Так как никто не указывал на возможное заражение эндофитами из воздуха, то в дальнейшем растения находились в обычных условиях и только иногда поверхность стаканов 'прикрывали парафинированным песком.
Семена стерилизовались сулемой или перекисью водорода, но так как в контрольных вариантах эндофиты не развивались, мы
