после чего производится осаждение и очистка растворов от посторонних примесей и по интенсивности флуоресценции определяется количество витамина с помощью шкалы гальванометра.
Для количественного анализа витаминов в чистых культурах эндофитов мы использовали как мицелий гриба, так и его нативную жидкость. Раздельное определение рибофлавина в культурах эндофитов, выделенных из корней сильно микотрофных растений ольхи и ирисов, установило его наличие в обеих фракциях. Большее содержание его в нативной жидкости (табл. 14) указывает на способность симбионтного гриба выделять витамины во внешнюю среду и снабжать ими растение в процессе их совместной жизни.
Таблица 14 Количество рибофлавина в чистых культурах эндофитов (мкг на 1 л питательной среды)
Как и в предыдущих исследованиях биологически активных веществ эндофитов, в этом опыте было установлено, что синтез ими витаминов определяется интенсивностью микотрофности растений, из которых были выделены грибы.
После выявления нами сильной микотрофности у картофеля на высокогорном стационаре АН СССР клубни различных сортов были направлены Е. А. Буш в Институт физиологии Грузинской академии наук для определения содержания в них витаминов. Результаты этих исследовании указывают, что картофель, выращенный в горных условиях, можно использовать как витаминный продукт (табл. 15).
Таблица 15 Содержание витаминов (мг на 100 г. сырой массы) в клубнях различных сортов картофеля в горных условиях
H. Г. Холодный (1939), присоединял витамины к группе фитогормонов, отметил их наличие в семенах и особенно в семенах злаковых растений, в которых витамины группы В находятся в зародыше и в алейроновом слое эндосперма.
Не было необходимости в проверке способности эндофитов синтезировать ферменты, поскольку жизненные процессы их, как и всех мицелярных грибов, катализируются экзо– и эндоферментами. Известно, что ферменты грибов участвуют не только в реакциях расщепления, но и реакциях синтеза (Лилли, Барнетт, 1953). Представляло интерес сравнить набор ферментов симбионтных и сапрофитных грибов, но такая большая работа выходила за пределы возможностей нашей лаборатории.
Б. А. Рубиным с сотрудниками (1945) было установлено, что при посеве сахарной свеклы в горах в районе Алма—Аты с увеличением высоты над уровнем моря от 1000 до 2500 м не только в 5 раз повышается содержание сахара в плодах, но значительно возрастает в клетках растении количество окислительных ферментов — пероксидаз и полифенолоксидаз. Эти ферменты обеспечивают устойчивость растений к патогенным агентам и кутинизацию тканей при их механических повреждениях. Для нас очевидно, что повышение защитного действия ферментов связано с увеличением микотрофности культур на больших высотах.
Когда–то считали, что сами растения не синтезируют ферментов, которые им не нужны, но после выявления участия ферментов в процессе дыхания в науке утвердилось мнение об их синтезе растениями. Об участии в этом процессе эндофитов никто не упоминает, что, по нашему мнению, усложнило правильное решение данного вопроса. Только в теории дыхания В. И. Палладина (1950) отмечается существование в растительной ткани посредников дыхания, названных им «дыхательными хромогенами», которые при окислении превращаются в пигменты. Последнее указание автора можно отнести к симбионтным грибам растений, так как пигменты синтезируют эндофиты. Сейчас при изучении чистых культур эндофитов можно внести ясность в сложный вопрос о дыхании растений.
Аминокислоты. Изучение аминокислот в богатом азотом мицелии гриба или в его нативной жидкости представляет известные трудности из–за наличия слизистых веществ, мешающих получению четкой хроматограммы. В связи с этим их изучение проводилось в 50 мл спиртовой вытяжки, очищенной от примесей стерильным углем, что соответствовало 150 мл нативной жидкости гриба, выделенного из корней женьшеня. Указанная работа проводилась в двух различных научных учреждениях: первый раз в 1968 г. С. М. Клуновой в Московском педагогическом институте, второй раз Е. Е. Колидзевой на кафедре кормления животных в Московской сельскохозяйственной академии. Использовались разные партии гормонального препарата Симбионт 1, приготовленные из одной и той же культуры симбионтного гриба. Во втором анализе было дополнительно установлено еще 3 аминокислоты: цистнн, гистидин и метионин, которые не были обнаружены в первом анализе, Всего было выявлено 15 аминокислот, синтезируемых чистыми культурами эндофитов из женьшеня (табл. 16).
Таблица 16 Синтез аминокислот (мг/л) из эндофитов женьшеня
Выявление аминокислот в чистых культурах симбионтных грибов в связи с их способностью к синтезу этих соединений по–новому освещает одну из наиболее сложных проблем образования белковых веществ в растениях. Открыт новый путь в разработке воздействий, направленных на увеличение количества аминокислот и нужного качества их состава в сельскохозяйственных растениях: накопление растительного белка можно обеспечить, стимулируя грибной симбиоз как агротехническими, так и селекционными средствами, например, подбирая родительские пары для скрещивания при учете наследственной передачи природных и приобретенных свойств эндофитов.
Выше мы показали, что лучшие сорта пшениц советских селекционеров обладают сильной микотрофностыо, обеспечивающей высокую белковость зерна. Нужно подчеркнуть, что применяемые для повышения белковости культур высокие дозы минерального азота часто не достигают своей цели и губительно действуют на развитие грибных симбионтов растений. Это способствует снижению способности эндофитов к синтезу аминокислот и увеличению уязвимости растений патогенами, тогда как превалирование фосфорных и калийных удобрении, применение микроудобрений, гормональных препаратов и органических удобрений, как и посевы по пласту трав, значительно повышают активность эндофитов и продуктов их синтеза.
Изменения, происходящие в морфологии эндофитов в корнях растений, растущих на почвах, обильно удобренных минеральным азотом, настолько велики, что многие исследователи, изучая их под микроскопом, отмечают вредное влияние избытка минерального азота на нормальное развитие эндофитов. Расширение гиф, не сопровождаемое накоплением хорошо окрашиваемых белковых веществ в везикулах, свидетельствует о том, что вместо снабжения растений аминокислотами эндофиты в указанных условиях превращаются в потребителей избыточного азота. Отчетливо проявляется вредность избытка азота, применяемого при выращивании одноклеточных культур. Он блокирует способность эндофитов к азотфиксации, что заставило нас снизить обычно применяемое количество азота в питательных средах при получении чистых культур эндофитов из тканевых культур.
