Первые такие инструменты и появились в 1990-х годах (помните, в главе 2 мы начали рассказ о Джошуа Ледерберге и генетической рекомбинации). Для того, чтобы заменить букву или несколько букв генетического текста нам надо провести рекомбинацию, — только так в клетке может произойти замена. А для того, чтобы она произошла именно в нужном нам месте, необходимо внести разрыв в цепь ДНК. Для этого использовались особые ферменты — нуклеазы. Кроме того, какой-то механизм должен их направить в нужное место и точно распознать именно ту последовательность нуклеотидов (назовем ее «генетическим словом»), в которой нам нужен разрыв.
Для этого стали использовать так называемые мегануклеазы. Это крупные белковые молекулы, которые, кроме нуклеазной активности, характеризуются протяженным «генетическим словом», или, как говорят ученые, сайтом, который они распознают. Обычно это «слово» состоит из пятнадцати-сорока нуклеотидов. Такие длинные слова уникальны для геномов. Например, одна из первых мегануклеаз, I-Ssel, распознает определенную последовательность из восемнадцати нуклеотидов, и такое их сочетание случается настолько редко, что может встретиться в генетическом тексте, только если он в двадцать с лишним раз больше генома человека. Недостатками мегануклеаз являлись незначительное количество распознаваемых «генетических слов» и их размер (мега!), то есть протяженность сайта распознавания. Все это осложняло проведение экспериментальных работ с ними.
Первый значимый прорыв в направленном распознавании генетического текста внутри клетки произошел в начале XXJ века. Тогда придумали искусственные распознающие нуклеазы, которые получили название нуклеазы типа цинковых пальцев (zinc-finger nucleases). Наиболее интересен данный тип нуклеаз с точки зрения творческого, дизайнерского подхода человека к использованию фундаментальных знаний, поэтому далее мы уделим им немного больше внимания, а заодно узнаем об очень важных генах.
Транскрипционные факторы
Мы уже говорили в главе 1, что в изученную часть ДНК человека, помимо самих генов, кодирующих белки, входят регуляторные последовательности — фрагменты ДНК, ответственные за работу гена. С химической точки зрения это такие же участки ДНК, как и гены, поскольку тоже составлены из четырех чередующихся в определенной последовательности нуклеотидов А, Т, Г и Ц. Как же эти участки ДНК могут регулировать работу гена?
Информация обо всех процессах в клетке записана в последовательности ДНК. Чтобы считать информацию с флешки, ее надо вставить в компьютер. Другим видом накопителя информации является стример. Он записывает информацию на магнитную ленту и используется в больших дата-центрах. Именно стримерам принадлежит рекорд по плотности записи информации на единицу площади. А принципиальное устройство стримера очень простое. Может, кто-то помнит или видел катушечный магнитофон: там две катушки, с одной лента сматывается, на другую наматывается, а посередине магнитная головка, которая касается ленты и считывает информацию, превращая ее в звук. Информация с ДНК — «магнитной ленты» — считывается такой же биологической «головкой». Этот «звукосниматель», который «озвучивает» ген, то есть делает его простую копию для преобразования в белок, называется транскрипционным комплексом, а процесс «озвучки» — транскрипцией. Транскрипционный комплекс собирается из нескольких белковых молекул, очень важно, чтобы он собрался в правильном месте, то есть выбрал правильный генетический текст для озвучки. За это отвечают так называемые транскрипционные факторы — белковые молекулы, которые узнают определенные комбинации «слов» (последовательностей нуклеотидов), носящих название промоторы.
И транскрипционные факторы, и промоторы эволюционно изменились очень мало, о чем свидетельствует их поразительное сходство у совершенно различных биологических видов, от плодовой мушки дрозофилы до человека. Это доказывает, что транскрипционные факторы были очень значимы в эволюции живых существ и, как мы теперь понимаем, играют огромную роль в функционировании наших генов.
Дело в том, что работа генов в организме подчинена тем же самым законам, что и устройство любого социума. Это значит, что в нем есть «господа» — такие, как транскрипционные факторы, а есть гены-«работники», которые подчиняются транскрипционным факторам. Один такой фактор может контролировать работу сотни генов, поэтому всего полторы тысячи транскрипционных факторов контролируют работу двадцати пяти тысяч генов.
Транскрипционный комплекс из транскрипционных факторов и различных кофакторов[8] как раз и задает все особенности транскрипции гена в определенной клетке и в определенное время. Изучать работу определенного гена в определенных условиях — это большая наука, но пока оставим эту тему в стороне.
Нас в данный момент интересует, что транскрипционные факторы очень хорошо умеют распознавать генетический текст, но все по-разному. Одни распознают текст очень специфично, и тогда не требуется слишком большой сборки из транскрипционных факторов и кофакторов, а другие — менее специфично, и тогда для повышения точности транскрипции генов могут понадобиться еще какие-то белки-помощники и еще один кофактор, которые осуществили бы «тонкую настройку».
Понятие транскрипционного фактора появилось в конце 1980-х годов, а чуть позже исследователи обнаружили целое семейство транскрипционных факторов, белковая структура которых имела повторяющиеся элементы, и эти элементы получили название цинковые пальцы.
Нуклеазы типа цинковых пальцев
Свое странное название эти фрагменты белковых молекул получили за характерную трехмерную структуру и наличие в их составе ионов цинка. Цинковый палец представляет собой последовательность аминокислот, состоящую из пары близко расположенных цистеинов (аминокислотных остатков), потом следует промежуток в полтора-два десятка любых аминокислот, и опять идут два близко расположенных цистеина или гистидина. Ионы цинка стабилизируют, удерживают эту конструкцию, связываясь координационными связями с двумя близко расположенными цистеинами. Представьте себе веревку с четырьмя завязанными узелками — это будут цистеины или гистидины. А теперь пальцами притяните все узелки в одну точку. Ваши пальцы сыграли роль иона цинка. У вас получатся три петли, которые можно назвать тремя пальцами. Так вот, каждый палец достаточно точно узнает три-четыре нуклеотида ДНК, расположенные в определенном порядке, и связывается с ними. Три пальца уже распознают девять-десять нуклеотидов — определенное слово генетического текста.
Рис. 6. Нуклеазы типа цинковых пальцев
Среди трех миллиардов букв, составляющих генетический текст ДНК, группа из трех-четырех букв попадается довольно часто. А вот если мы возьмем сочетание пяти-шести цинковых пальцев, которые однозначно определят последовательность примерно пятнадцати-семнадцати нуклеотидов генетического текста, то с вероятностью девяносто девять целых и девять десятых процента это будет уникальная последовательность среди трех миллиардов букв.
Конечно,
