Пожалуй, более любых других исследователей, занимавшихся изучением стволовых клеток, профессор Яманака горел желанием найти способ создания в лабораторных условиях плюрипотентных клеток из дифференцированных клеток. Приступив к этой работе, он располагал списком из 24 генов, имеющих жизненно важное значение для ЭС клеток. Все они принадлежали к числу «генов плюрипотентности» — они должны были оставаться активированными, чтобы ЭС клетки могли сохранить свою плюрипотентность. Если с помощью различных экспериментальных техник эти гены репрессировались, то ЭС клетки начинали дифференцироваться (как те самые сокращавшиеся клетки сердца в чашках с культурой) и уже никогда не возвращались к своему первоначальному состоянию ЭС клеток. Отчасти именно это и происходит в процессе естественного развития млекопитающих, когда клетки дифференцируются и становятся специализированными, — они «отключают» свои гены плюрипотентности.
Шинья Яманака решил проверить, не обратят ли некие комбинации этих генов биологическое время дифференцированных клеток вспять, не отодвинут ли их на более ранние стадии развития. Работа ему предстояла долгая и трудоемкая, причем имело место обоснованное опасение, что, если результаты окажутся отрицательными, то есть если ни одна из этих клеток не «откатится» в свое прошлое, то он не сможет узнать наверняка, в чем причина такого завершения экспериментов — в том, что это невозможно в принципе, или в том, что не были верно соблюдены условия проведения экспериментов. Это был рискованный проект даже для такого авторитетного ученого как Яманака, но еще больше подводных камней он таил в себе для его юного помощника Такахаши, поскольку тому только предстояло взбираться по лестнице своей научной карьеры.
Когда герцогу Веллингтону стало известно о возможности обнародования его личной интимной переписки, грозившей нанести ему значительный вред, он произнес свои ставшие крылатыми слова: «Публикуйте и катитесь ко всем чертям!» Мантра ученых практически такая же, однако она отличается одним очень важном нюансом. Для нас она звучит «публикуйте или катитесь ко всем чертям» — если вы не публикуете свои научные труды, то не получите для них финансирования и не найдете работу в университетах. И крайне немного шансов у вашей работы быть опубликованной в солидном научном журнале, если весь ваш рассказ о годах напряженного труда можно выразить в одной фразе: «Я старался, старался, но у меня ничего не получилось». Так что желание заняться проектом, имевшим относительно небольшую вероятность завершиться положительным результатом, с полным правом можно назвать отчаянно смелым поступком, а перед Такахаши, в частности, нам остается лишь снять шляпу.
Яманака и Такахаши, имея в своем распоряжении 24 гена, решили испытать их в клеточном типе, известном как МЭФ — мышиные эмбриональные фибробласты. Фибробластами называются основные клетки соединительной ткани, присутствующие в самых разнообразных органах, включая кожу. Извлечь их очень легко, и они быстро растут в культуре, поэтому представляют собой превосходный клеточный материал для проведения экспериментов. Поскольку клетки МЭФ, как следует из их названия, получают из эмбрионов, существовала надежда, что они, будучи помещенными в подходящую среду, вспомнят хоть немногое о своем происхождении и сумеют вернуться к более ранним стадиям собственного развития.
Помните, как Джон Гердон в своих экспериментах выбирал доноров и акцепторов среди лягушек разных групп, обладавших различными маркерами генетического кодирования, чтобы определить, какие именно ядра развиваются в новых животных? Нечто подобное проделал и Яманака. Он брал клетки у мышей, имевших предварительно добавленный лишний ген. Этот ген называется геном неомициновой резистентности (neoR) и действует в полном соответствии со своим наименованием. Неомицин — это принадлежащее к антибиотикам соединение, которое в обычных условиях убивает клетки млекопитающих. Но если клетки были генетически перестроены для экспрессии гена neoR, они выживут. Когда Яманака готовил мышь, необходимую ему для проведения экспериментов, он особым образом добавил ей ген neoR. Это означало, что ген neoR должен активироваться лишь в том случае, если клетка, в которой он находился, станет плюрипотентной. Эта клетка должна была повести себя так, как будто она стала ЭС клеткой. То есть, если эксперименты по насильственному возвращению фибробластов в состояние недифференцированной ЭС клетки окажутся успешными, клетки будут продолжать расти даже при добавлении в них летальной дозы антибиотика. Если же эксперименты завершатся неудачей, все клетки погибнут.
Профессор Яманака и доктор Такахаши ввели 24 гена, которые они хотели протестировать, в особые молекулы, называемые векторами. Эти молекулы исполняют роль троянского коня, доставляя в клетку высокие концентрации «дополненной» ДНК в фибробласты. Оказавшись в клетке, эти гены должны активироваться и начать вырабатывать специфические для каждого из них белки. Введение векторов может быть осуществлено довольно просто одновременно в большое количество клеток при помощи химической обработки или электрического импульса (никаких кропотливых микро-инъекций, только не для японских исследователей!) Когда Шинья Яманака вводил все 24 гена одновременно, некоторые клетки оживали после обработки их неомицином. Доля их была крошечной, но, тем не менее, это был впечатляющий результат. Из него следовало, что эти клетки активировали ген neoR. Они и начинали вести себя соответственно, как ЭС клетки. Но если он вводил гены поодиночке, ни одна клетка не выживала. Тогда Шинья Яманака и Казутоши Такахаши стали вводить в клетки различные комбинации из 23 генов. Результаты этих экспериментов они использовали для идентификации десяти генов, каждый из которых был необходим для создания неомицин-резистентных плюрипотентных клеток. Пробуя различные сочетания этих десяти генов, они, наконец, опытным путем определили минимальное количество генов, которые, действуя совместно, превращали фибробласты эмбриона в ЭС клетки.
Волшебное число оказалось четверкой. Когда в фибробласты вводились векторы, несущие в себе гены, называемые Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, происходило нечто совершенно невероятное. Клетки выживали в неомицине, демонстрируя тем самым, что они активировали ген neoR, и как следствие, становились подобными ЭС клеткам. И это не все — фибробласты начинали менять форму и внешне превращаться в ЭС клетки. Прибегая к разнообразным экспериментальным системам, ученые смогли преобразовать эти перепрограммированные клетки в три основных типа тканей, из которых формируются все органы млекопитающих — эктодерму, мезодерму и эндодерму. Именно это и проделывают обычные ЭС клетки. Фибробластам такое просто не по силам. Затем Шинья Яманака продемонстрировал, что он может повторить весь процесс, пользуясь в качестве исходного материала фибробластами взрослых мышей, а не эмбрионов. Это стало доказательством, что успех его метода не зависит от каких-то особенностей эмбриональных клеток, но может также применяться при работе с клетками полностью дифференцированных и зрелых организмов.
Созданные им клетки Яманака назвал «индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками», и аббревиатура этого термина — iPS (иПС) клетки — сегодня уже прочно укоренилась в профессиональном языке всех, кто занимается биологическими исследованиями. Если только представить, что каких-то пять лет назад этого словосочетания просто не существовало, а теперь оно пользуется всемирным признанием среди ученых, то мы поймем, насколько важен и велик был этот прорыв в науке.
